編者導語
首先，非常榮幸的邀請到袁超博士做客“臨床質譜網媒體平臺”。為了答謝業內同行的厚愛，我們將會在“專家講壇”欄目中持續發布袁老師有關臨床質譜的應用、標準品、線性、權重、同位素內標、離子抑制、基質效應等精彩干貨內容，以饗讀者。承接上期，本期袁老師為大家帶來臨床分析中最核心的部分標準品和標準曲線的精彩介紹。
作者簡介
袁超博士
現任美國華人臨床化學學會主席，美國大型臨床檢測實驗室質譜實驗室主任。于四川大學獲得生物化學學士學位、美國堪薩斯大學獲得生物化學博士學位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學做博士后，主要研究方向為蛋白質組和質譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質譜方法開發和應用。
第四節 標準品與標準曲線
任何知識都不是孤立的，就像房頂的瓦，一片壓著一片。想要揭開其中的一片，往往要先揭開旁邊的幾塊兒。如此類推，往往不知應該從哪兒開始下手。想來想去，決定單刀直入，選取最核心的一塊瓦，標準品。
臨床檢測的數據要想測的準，離不開一條好的標準曲線。通俗來講，標準曲線就像一把尺子。只有把尺子做準確了，才能把未知物品的長度測準確。從科學上來講，標準曲線就是檢測物質的濃度和儀器讀數的一種線形關系。一般是濃度越高，讀數越大。標準品的濃度是已知的，高中低都有。測完標準品以后，把它們的濃度和儀器測得的讀數在x/y的坐標紙上一畫，連一條線就成了。測未知的病人樣品時，濃度（x)是未知的，只有儀器的讀數(y)，通過這條曲線可以把y換算成濃度。
標準品應該怎么做，怎么用，這里面有很多學問。質譜是新鮮技術，大多的檢測項目還買不到標準品，只能自己配。做標準品需要有純樣品。最好的純樣品應該是濃度和純度都有保證書的，這樣用起來放心。如果是液體的溶液就更好了，省去自己稱量和溶解的麻煩。高濃度的純樣品要稀釋到不同的低濃度才能使用。用什么來稀釋是下一個非常關鍵的步驟，這里面牽扯到基質效應。這個留作以后再討論，因為基質效應這塊兒瓦是質譜臨床應用里比較難理解的一個概念。
標準品的濃度范圍怎么定，最高定多高，最低定多低？這個要根據臨床的需要和實驗室的實際情況來定。一般的情況下是標準曲線要覆蓋95%病人樣品的濃度，最好是能覆蓋99%的病人。這樣只有1%的病人濃度在標準品范圍之外。濃度太高的病人樣品需要稀釋后重做才能出報告的。所以標準品濃度范圍大的好處是降低重復率。重復率對病人、對實驗室都是一個壞事情。對病人來說，延遲了得到結果的時間，對實驗室來說增加了開支。那么可不可以把超過標準品范圍的濃度直接出報告，不做稀釋呢？答案是可以的，但有限制條件。最高可以超出最高點的50%，最低可以比最低標準品低50%。為什么是50%呢？沒有道理，是行業共識。這樣做的代價是什么呢？是每半年要做一次線性范圍的驗證。線性范圍的驗證留到以后再講，反正每半年需要做這么一次試驗，還挺麻煩的。為什么是半年呢？又是行業共識。以后還會遇到很多的行業共識的東西，我就不一一點出來了。要想不麻煩，那就把標準品范圍做寬，做得和線性范圍一樣寬，這樣就不用每半年做一次驗證了。但下一個限制條件就又來了，最高的濃度總不能超過純品的濃度吧？另外濃度高了，用的純品也就多了，價格也就上去了。所以最后濃度范圍的選定是根據多方面的因素綜合選定的。
有了最高和最低的濃度，中間的怎么辦呢？放幾個點，濃度定在哪里？定幾個點要看最高和最低的濃度的差異，相差越大，點數越多，一般差一個數量級放要三個點。總數一般都是奇數，比如五個、七個、九個，就像政治局常委和聯邦最高法官的數目，表決的時候不會騎墻。中間點的濃度既要照顧臨床的需要，有要便于配置。臨床上有病沒病的臨界點附近要放一個點；濃度最好是等差等比的梯度，比如2、4、8、16、32這樣的，配的時候要容易些。配溶液的基本操作和器皿的選擇放到另外的章節再講。不是每個人的手藝都過關的。用微量移液器（俗稱槍）稱水的重量，做六次，CV能到1.5%以內人才有資格去配標準品。
標準品是有保質期的，在保質期結束以前要把下一批的標準品做出來。通常會把兩批標準品放在一起跑，再加上10到20個病人樣品。濃度高和低的病人樣品都要有。用新舊的標準品測出來的數據不能差太大，最好是TEa的1/3或1/4以內，一般是5%到10%。TEa留到以后再講。如果新標準品通過了這個檢測，下面有兩個選擇來決定新標準品的濃度。一是用算出來的預期值，另一個是用測得的實際值。這里面的細微差異是公婆說理，我就不展開討論了。
標準品是把每個濃度都配出來，分裝、冷凍，還是就把最高的濃度配出來，用的當天再做稀釋配其它濃度？這里面沒有硬性的規定，主要看你實驗室的冰箱有多大。標準品是一次用完就扔掉，還是可以重復使用直到用光？這個也沒有規定，要看重復使用時，樣品的穩定性和低濃度的標準品被污染的情況有多頻繁。
標準品使用的頻率應該怎樣定？目前為止，我看到的都是每批樣品都要做一套標準品。這一批跑的標準品不能借到別的批次病人樣品里去，除非有主管或主任的簽字。注意這里我應到了"除非"這個詞。這就是綜合考慮遵循條例和實際工作情況的反映。按道理是不能這樣做的，可是如果你知道標準曲線一般不會變來變去，其中一條明顯是因為重復使用被污染了，QC和其它指標都正常時，借一條當天干凈的標準曲線就是一個合理的變通選擇。當然，這個選擇的權利不能下放到普通的實驗員手里。
一批樣品里可不可以做兩條標準曲線，選好的哪一條呢？沒有硬性規定。但是如果跑兩次就又一次失敗的話，這個方法本身就不過硬，需要回爐重新加工。如果標準曲線每次變化不大，可不可以一條曲線一天內重復使用，一個星期之內呢？目前還不可以。可不可以不用標準曲線，只用內標和內標的濃度來算呢？這個想法很新穎，但還沒有被廣泛認可，除非是做半定量。
標準品跑出來不一定都在一條直線上，會有偏差。偏差多少可以接受呢？一般是15%，最低點可以用20%。如果超出了這個范圍可以去掉嗎？答案是可以的，但是有限制。每四到五個點可以去掉一個點。如果沒有哪個點超過15%，但是QC出去了，可不可以去掉一個標準品的點讓QC通過呢？答案是不可以的，除非有實驗室負責人的簽字。色譜峰可以手工調嗎？答案是不可以的，尤其是內標的峰。被測物質的峰在低濃度時容易被雜峰干擾，手動選峰可以有條件的接受。最低的點可以被排除嗎？一般不可以，除非所有的病人樣品都比第二低的點高。同理，如果把最高的點給排除了，所有高于第二個高點的樣品都要重做。
除了每個點的偏差，整條線的相關性 （correlation）要大于0.99或0.995。具體數值從實際結果中來。色譜峰的參數，比如保留時間，峰寬，baseline可以變化嗎？理論上是不可以的。但在實際應用中，隨著色譜柱的使用次數增加，這些參數都會變。最好是在做方法驗證時，把這些考慮進去，確定舊柱子也能通過方法驗證。這樣臨床時就有心理底氣去release舊柱子所產生的不是很理想的峰的結果。
聲明：本文章來源“臨床質譜網”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質譜網和袁超博士授權，如需轉載，請聯系原作者！
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