編者導語
非常榮幸邀請到袁超博士做客“臨床質譜網媒體平臺”。我們會在“專家講壇”欄目中持續發布袁老師有關臨床質譜的精彩干貨內容，以饗讀者。本期袁老師為大家帶來干擾物的精彩解讀。
作者簡介
袁超博士
現任美國華人臨床化學學會主席，美國大型臨床檢測實驗室質譜實驗室主任。于四川大學獲得生物化學學士學位、美國堪薩斯大學獲得生物化學博士學位，其后在霍普金斯和伊利諾伊大學做博士后，主要研究方向為蛋白質組和質譜。袁超博士最近十年主要從事臨床質譜方法開發和應用。
第十節 干擾物
干擾物是臨床檢測的方法驗證里必做的一項。但是干擾物對不同的科室來說，含義大不一樣。如果說臨床化學是一棵樹的話，每一個科室，比如化學，免疫，還有質譜，只是這棵樹上的一個分支。干擾物就像樹上的鳥，分別站在每一個枝頭。但是此鳥非彼鳥，化學方法里的干擾物在很多情況下是不會干擾免疫和質譜方法的。但因為歷史的原因，每次驗證質譜方法時都要把化學方法里的干擾物測一遍，而該測的干擾物往往漏掉了，在后來的工作中會造成麻煩。所以質譜法的干擾物測定要有特殊的程序。
化學光吸收法里的干擾物主要是溶血，脂血，和黃疸，因為這些物質都可能吸收、反射、或折射光波。免疫法里要測的干擾物應當包括各種自身抗體，人抗動物抗體、抗試劑抗體、生物素、交叉反應，等等能影響抗體抗原反應的物質。免疫法并不是一個直接的檢測手段，要通過抗原抗體的結合來發生。而抗體抗原反應又比較復雜，容易被干擾。這也是大家普遍認為質譜法特異性更好的原因。在質譜檢測里，被測物從上千種物質里逐步被分離出來，最后撞在光電倍增管里，產生一個電子信號，作為定性和定量的基礎，其特異性是其它方法不可比擬的。但這不表示質譜法里就沒有干擾物了。
在液質聯用的方法里，能成為干擾物是一件很不容易的事情，必須和被測物是isocratic 和 isobaric。也就是說在色譜上和在質譜上都是分不開的。色譜的分離是基于疏水性，分子結構等理化性質。如果某種物質的理化性質和被測物相近，那就會和被測物一起從色譜柱里出來。如果這個物質不能被質譜檢測到，那就只是會和被測物以及內標爭搶離子，形成離子抑制。如果它正好和被測物的分子量相同，而碰撞斷裂后有相同的離子片段，那就會被質譜檢測到，成為“能看得見”的干擾物。
干擾物往往不會和被測物的保留時間完全一樣，這樣就形成了一個多余的峰肩，在主峰的前或后。干擾物的峰型有可能不對稱，因為我們的色譜梯度不是針對干擾物來設計的。這種情況下就會形成拖尾。這樣的峰與被測物的峰疊加在一起，形成不正常的峰型，很容易被看出來。不單單是被測物有干擾物，內標也會有干擾物。內標的干擾物往往會把內標的峰面積增加，很容易被看出來。在方法開發時，可以做一批不加內標的病人樣品，看哪一個離子對比較干凈，就選用哪一個。方法開發好上了臨床以后會碰到很多意想不到的問題。一般一個新方法上臨床一年以后沒有問題才算可靠。季節性的藥物，新藥，新的抽血的管子，新的試劑，新的包裝等等，這些都有可能含有干擾物。所以在方法開發和驗證時可以多選用幾個備用的離子對，一旦有干擾物，可以頂上。一般選2-4個。
說起離子對的選擇，這里面的學問很多。大多數人是選豐度最高的那一個。我的經驗是選豐度高的離子對不如選特異性好的。掉水，掉氨基，掉羧基，掉甲基、掉乙基的離子對特異性都不會好；碎片是苯環或苯環類似物的也不好；如果用延伸的話，要注意不要用延伸化試劑的離子。內標的片段最好也是選用特異性的片段。比如掉HDO的片段就比掉H2O的特異性高很多。實際情況不可能保證每個化合物都能找到2-4個可用的離子對。有時候只能退而求其次。甚至連【母離子-母離子】這樣的離子對我也用過。這個化合物就像個硬核桃，你用錘子敲它，勁兒使小了砸不開；勁大了，砸碎了，一地渣渣，找不出一個可用的片段。我只好選用了一個比把它砸碎了的能量小一點的碰撞電壓，希望這個電壓能把可能有的干擾物砸碎，但我要的核桃還是完整的。另外一個比較奇特的例子是碰撞后的不穩定性。這個化合物在碰撞后可以丟A基團，也可以丟B基團，但兩個的信號都不穩定。這時候我選用了兩者之和，信號才算是穩定下來了。不穩定的情況還會發生在離子化這個階段，尤其是溶液中的離子，比如鹽，有可能附加在被測物之上，這樣的話，會造成信號不穩。這個時候就要用一個小的電壓去敲一下被測物，希望能把這個附帶的離子敲下去。當然，這一步發生在進Q1之前，不同廠家對這個電壓有不同的叫法。在這個環節還有一個氣體，它的流動方向是跟離子運動的方向是相反的。我的經驗是在不影響信號強度的情況下，把這個氣的流速調的越大越好。因為反方向吹，可以把雜質吹走。這個氣的使用和以前手工揚麥的原理相似：麥子落下時，風可以把癟的麥粒和麥皮給吹走了，飽滿的麥粒垂直落下來，被純化、富集。所以這個風速要調到大的剛好吹不走麥粒，才能減少污染物，干擾物。建一個穩定的、干凈的、污染物少的質譜方法有很多竅門。因為篇幅限制，我不可能一一列舉，先講到這里。關鍵是要對儀器的各種參數的了解、運用、思考、和試錯。
不管事前準備的多充分，實際情況是出乎意料的復雜。干擾物的出現往往防不勝防。怎樣去發現有干擾物呢？除了看得見的峰型的改變，還有兩個指標。一個是離子對的比值，一個是保留時間。如果我們檢測兩個以上離子對，那他們之間的比值應該是相對固定的，如果偏高或偏低，那就是有干擾物了。偏高或偏低的界定在CLSI的法規里有。一般對低豐度的離子的要求相對較寬泛。所以在具體操作時可以在合乎規定的范圍內做出對運營有利的選擇。比如人為的加大碰撞電壓，使定性的離子對的豐度降低，低到是定量的離子對的豐度的10%以下，這樣就可以按照規定選用一個比較寬的范圍。還有一些其它技巧，比如同一離子的多次使用，因為用文字解釋起來比較復雜，我就不在這里介紹了。法規里一個值得改進的地方是對濃度低的要求應該寬泛一些，因為這時候信號和噪音的差別已經不大了，尤其是到了已經沒有臨床意義的低濃度時。另外，廠家的軟件也有待改進，濃度低時，如果離子對比值超標，這樣的峰就不要特殊的標出來了，直接給個小的定量就可以了；如果定的量在LOQ之下，就沒有必要再去深究是不是有干擾物把離子對的比值搞亂了。離子對的比值按理是應該不變的，但是除了上述的濃度之外，還有其它因素。比如不同儀器，尤其是不同廠家的儀器之間；每次做完儀器維修之后；不同的流動相，等等，這些因素都會改變不同離子對之間的比值。有的廠家的軟件設計的比較合理，是自動選用同一批次里的標準品的離子對比值來衡量病人樣品。這樣就會把其它干擾因素給去掉。
從保留時間也可以看出有沒有干擾物。不是看絕對的保留時間，也不是看相對保留時間（相對保留時間是用在內標是類似物的情況下），而是看被測物和內標的保留時間的差值。氘標記的內標疏水性差，從反向柱出來的時間會稍早一點兒。如果是被測物先出來的話，就有可能混的有干擾物了。具體用什么范圍來衡量要從實際中來。標準品和質控品干凈，沒有干擾物。把他們的時間差算個平均數，范圍是正負2SD或3SD就可以了。注意要在計算時把軟件里保留時間的小數點后面多放幾位。保留時間的差值超出范圍，甚至峰型都被改變了，也不見的就肯定有“看得見”的干擾物。有可能是“看不見”的干擾物搗的亂。這時，“看不見”的干擾物只抑制了被測峰的部分（前半部或后半部），所以才會把峰型搞亂，把保留時間擠的靠前或靠后，這時候可以用稀釋法來檢測（見上節）。最麻煩的是“看得見”和“看不見”的干擾物同時存在，使得結果很不可靠。這時候就只能說“因為有干擾物而出不了報告了”。另外干擾物有可能是上一個樣品里的，因為色譜沒有洗干凈，雜質被帶到了下一個樣品里來了。把被干擾的樣品重新上次一樣就可以解決這個問題。有的雜質多的樣品會干擾接下來的兩個，甚至三個樣品，或者直接就把色譜柱子給毀了。重復測一次，它又毀一根柱子。這種時候 ，我都想找客戶倒賠我們錢。這種都是極端的例子，有些確實是因為病人在進行一項特殊的治療，血液里有大量的特殊藥物。如果這種毀柱子的情況經常出現的話，說明方法不夠好，需要把樣品弄的更干凈些再進樣。
如前所述，如果某個病人的內標的峰面積過大時，也可能是因為干擾物引起的。所以內標最好也要使用幾個離子對。很多法則里對內標的離子對數目沒有硬性規定。但是我個人感覺還是有至少兩個比較好。
另外，還要把干擾物和污染物區別開。污染物就是被測的物質，但是不應該出現在樣品里。它的產生原因五花八門。例如實驗操作不規范，使用天平時沒有清理干凈，把后面的試劑、溶液給污染了；廠商在產品制造過程過程中無意中引進的污染；員工本身無意引進的污染（吸煙者的尼古丁，懷孕婦女超高的雌激素，等等）。這種情況下，空白和雙空白可以看出來。另外每次從廠家收到內標以后，都要單獨檢測一下，看里面有沒有不帶標記的被測物。雖然軟件里可以用數學的方法把內標里混進去的被測物去掉，但最好是拿到干凈的內標為最好。
如果真的出現干擾物了，怎么辦？首先是換一下離子對，看問題能不能解決。如果備用的離子對是好的，而且也被驗證過，那報告是可以出的。如果發現大多數被干擾的樣品都可以用備用的離子對解決，那可以考慮永久的換一下離子對。有時候自己實驗室解決不了，可以把樣品送到其他實驗室，換一個方法說不定就不干擾了。
建質譜方法時，要測試可能成為干擾物的類似物。可以查文獻看以前有哪些報道；可以查分子庫，看有沒有分子量相近的化合物。有的話，要拿來測一測。這個要比測溶血，脂血更有意義。
本節的總結：
1. 質譜法的干擾物有別于其他方法，只有色譜和質譜都分不開的物質才有可能成為干擾物。
2. 干擾物可以從峰型，保留時間，和離子豐度比值來鑒定出來。
3. 解決干擾物的問題要從建方法時開始，需要有大量的儀器操作和方法開發的經驗。
4. 真是有解決不了的問題，只能老老實實的在報告里說明，不要把不可靠的結果上傳。
聲明：本文章來源“臨床質譜網”，作者：袁超博士，豪思生物已獲得臨床質譜網和袁超博士授權，如需轉載，請聯系原作者！
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